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即時聚合○s鎖反應(Real-time PCR)在植物病蟲害檢測上之應用 發佈時間:2008/8/25
即時聚合○s鎖反應(Real-time PCR)在植物病蟲害檢測上之應用

防檢局 汪澤宏

一、前言

  自從聚合○s鎖反應(PCR)技術開發至今,幾乎是生物學門中最被普遍使用的技術。PCR主要是運用DNA的變性、黏合及延伸等三步驟的循環,連續增幅目標DNA片段。在人類的疾病或其他動植物的疫病蟲害檢測上,以PCR為基礎的技術都被廣泛的應用,諸如多重聚合○s鎖反應(Multiplex PCR)、巢式聚合○s鎖反應(Nested PCR)、逢機增幅多態型-聚合○s鎖反應(RAPD-PCR)、序列特徵化增幅區域(SCARs)、聚合○s鎖反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)以及即時聚合○s鎖反應(Real-time PCR)等。其中Real-time PCR近年被使用的頻率逐漸提高,除了反應時間大量的縮短之外,儀器及技術的亦不斷的創新進步,真正可以做到兼顧到準確度、敏感度及高效率的多項優點。

二、Real-time PCR原理與方法

  Real-time PCR跟傳統PCR不同之處在於前者可經由光學系統去監測反應中產物量(螢光物質)的變化而反應在電腦上,後者則必須等反應結束後再進行洋菜膠體電泳分析。Real-time PCR的配備主要有PCR機器、光學系統及電腦(如圖1)。隨著技術的改良進步,Real-time PCR在精確度及敏感度都優於傳統PCR。目前Real-time PCR螢光系統可大致分為「非探針型」及「探針型」。

(一)「非探針型」的系統就是在反應中加入會與雙股DNA嵌合而釋放出螢光的物質,目前最常被使用的螢光染劑是SYBR-green I,這種物質會嵌入在雙股DNA的小凹槽(minor groove)而釋放出可被偵測的螢光,所以當PCR產物越多時,嵌入的SYBR-green I就越多,釋放出的螢光也就越多。

(二)「探針型」系統相對上就較為複雜,反應中除了要有專一性的引子對之外,另外還要在引子對之間DNA序列中找到具有專一性的片段來作為探針,如果不是目標物種來做偵測,探針就不會雜合到核酸上,之後也就不會釋放出螢光而被偵測到,所以「探針型」系統的專一性也就相對比較高。

三、Real-time PCR的優缺點

  Real-time PCR的優點就實驗時間可以大幅縮短,也可在電腦上即時監測實驗結果,且鑑定的專一性、敏感度及準確度也較一般PCR方式為高。檢測過程不用進行洋菜膠體電泳分析,除了可以節省時間及洋菜膠的材料費外,也可避免多做這個實驗所造成的污染及操作誤差。此外,不論使用探針或非探針的方法,Real-time PCR皆可精準定量,確定目標DNA的初始濃度,這對於植物防檢疫中的抗病育種及輸入農產品檢測方面,特別具有意義。而傳統PCR僅能用於定性分析,至多能達到「半定量(semi-quantitative)的程度。甚至已有廠商開發出手提式的Real-time PCR機器,可在野外或田間都使用直接進行檢測。而Real-time PCR的缺點則是機器及反應耗材的費用相對較高,造成目前在使用上無法達到普及化的主要原因。

四、Real-time PCR在檢測植物病蟲害之應用

  目前應用Real-time PCR在偵測植物病蟲害的例子越來越多,病害諸如馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)、番茄斑點萎凋病毒(Tomato spotted wilt virus)、葡萄皮爾斯病菌(Xylella fastidiosa)、青枯病菌(Ralstonia solanacearum, race 3, biovar 2)及柑橘黃龍病菌(Candidatus Liberibacter spp.)等。在害蟲的檢測上,目前已有開發數種鱗翅目捲葉蛾害蟲、果實蠅及南黃薊馬等。

(一)植物蟲害:以蘋果重要害蟲---蘋果蠹蛾(Cydia pomonella)為例,蘋果蠹蛾是國際上重要的檢疫害蟲,分布在許多溫帶國家,對蘋果及梨等溫帶果樹造成極大的損害,牠也被台灣列為重要的檢疫對象,近年來多次在進口蘋果中被檢出,所以開發精確、穩定而快速的鑑定方法就顯得相當重要。Barcenas等人以四種為害蘋果的重要捲葉蛾(包括蘋果蠹蛾)為材料,將粒線體中的氧化還原酵素I(Mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I, COI)片段加以定序、比對,然後利用上述的DNA序列設計每一種捲葉蛾的專一性引子對,利用PCR反應及螢光染劑(SYBR-green)嵌合在目標產物上,而光學儀器偵測螢光反應,並將訊息傳到電腦上以提供即時的反應資訊,這樣便可以快速的得到監測結果,這項偵測技術已經在墨西哥的檢疫單位實際應用。

(二)植物病害:以柑桔類重要病害--柑橘黃龍病的例子來看,此病為一類分布於植物韌皮部的特殊細菌(Candidatus Liberibacter spp.)所造成,目前有亞洲、非洲及美洲三型,對於柑桔產業的危害相當嚴重,如何快速而精準的鑑定此病原菌在植物檢疫或防疫上都非常重要。美國農部的研究人員於2006年發表一篇以Real-time PCR快速鑑定柑橘黃龍病病菌的論文(Li et al., 2006),他們以TaqMan的方法,開發了多組的引子對及探針,快速而精準的鑑定亞洲型及美洲型的黃龍病菌,其中他們也加入了其它柑橘病害病原菌(如柑橘潰瘍病菌等)來測試此技術的專一性,這項技術的開發除了目前已應用在佛羅里達州來偵測亞洲型的黃龍病病菌外,也可適用於全球其他國家進行植物檢疫或防疫的病原鑑定參考。

五、結語

  Real-time PCR有快速、精準及專一等鑑定的功能,但是否真的能準確檢測出目標物種,除了實驗條件的設定,不斷的測試才能確定該項檢驗技術的穩定性,而這些技術的根本則有賴於害蟲及病原菌基因資料庫的建立與累積,在建立基因資料庫之前,物種(species)、分化型(forma specialis)、病原變種(pathovar)、生理小種(race)必須先加以鑑定釐清,基因資料庫來源的證據標本(voucher specimens)或菌株都必須妥善保存,避免日後發現先前鑑定有問題時無法再驗證。隨著此項技術的使用普遍化,反應所需的耗材與藥劑價格也可能逐步下降,使用的花費也就越來越能被接受,應用在植物的疫病蟲害上的機會就可大幅提高,在可預見的未來,Real-time PCR在植物防檢疫的工作上將扮演更重要的角色。

http://www.coa.gov.tw/view.php?catid=13001轉貼

 
 
 
 
   
   
 
 
 

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